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Jahrhundert angewendet, das der Werkstatt von Sandro Botticelli zugeschrieben wird.Diese Methode ermöglichte die sichere Identifizierung der proteinbasierten Bindemittel und ihrer biologischen Herkunft sowie die Unterscheidung der Bindemittel, die in den Grund- und Farbschichten des Gemäldes verwendet wurden.Diese Ergebnisse zeigen, dass der Ansatz aufgrund der begrenzten Menge an erforderlichem Ausgangsmaterial genau, hochsensibel und im Bereich des kulturellen Erbes breit anwendbar ist.Dementsprechend wird eine Reihe von Richtlinien vorgeschlagen, die die wichtigsten Schritte der Datenanalyse und Interpretation von Proteinsequenzierungsergebnissen abdecken und für Kunstwerke optimiert sind.Detaillierte Kenntnisse der in einem Kunstwerk vorhandenen Materialien sind erforderlich, um seine Geschichte zu rekonstruieren, die Techniken der Künstler zu verstehen, die besten Ausstellungs- und Aufbewahrungsbedingungen zu definieren und angemessene Restaurierungsbehandlungen zu planen.Die genaue Zusammensetzung künstlerischer Objekte ist selten a priori bekannt und kann potenziell eine Vielzahl anorganischer und organischer Verbindungen umfassen1,2.Zeitgenössische schriftliche Berichte sind ein nützlicher Leitfaden zum Verständnis der Materialien und Techniken, die in Gemälden verwendet werden2, jedoch können Informationen über die spezifischen Praktiken einzelner Künstler nur durch die Anwendung der instrumentellen Analyse aufgeklärt und mit Informationen in schriftlichen Quellen aus dem verglichen werden Künstler selbst3.Darüber hinaus erhöht der Abbau der Materialien die Komplexität der Farbmatrix erheblich, was zu erheblichen Änderungen ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften führt und manchmal das Erscheinungsbild des Objekts beeinträchtigt4.Angesichts der kulturhistorischen Bedeutung von Kunstwerken werden minimalinvasive Analysen bevorzugt.Daher ist der erste Untersuchungsansatz üblicherweise nicht-invasiv, dh ohne Kontakt mit dem Objekt5.Die Verwendung nicht-invasiver Techniken zur Identifizierung anorganischer Komponenten ist gut etabliert und die Ergebnisse sind im Allgemeinen schlüssig6,7,8,9,10.Andererseits sind die Ergebnisse zu organischen Bestandteilen weniger spezifisch, da diese Techniken bestenfalls nur die Identifizierung der vorhandenen Molekülklasse(n), z. B. Protein, Öl usw., und selten die Bestimmung ermöglichen können des spezifischen Materials, z. B. Tierleim versus Ei11,12,13,14,15.Detaillierte und genaue Informationen über organische Materialien werden im Allgemeinen durch invasive oder destruktive Techniken bereitgestellt, die die Entnahme einer Probe beinhalten, die nach der Analyse konserviert bzw. zerstört werden soll11,16.Sampling-Strategien sind so konzipiert, dass sie so wenig Einfluss wie möglich haben, indem sie die Menge des gesammelten Materials minimieren und Mikroproben aus Bereichen mit bestehenden Schäden oder von den Rändern des Kunstwerks entfernen.In Gemälden können proteinbasierte Materialien als Bindemittel in Präparations- und Malschichten, Lacken, Schutzschichten oder Klebstoffen2,17 verwendet werden, und mehrere Analysetechniken werden für ihren Nachweis und ihre Analyse verwendet18.Die Verwendung von auf Massenspektrometrie (MS) basierenden Proteomik-Ansätzen zur Untersuchung alter Proteinreste, dh Paläoproteomik, hat in der wissenschaftlichen Gemeinschaft in den letzten zwei Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung gewonnen19.Die erste Anwendung von MS-basierter Proteomik auf antike Materialien geht auf das Jahr 2000 zurück20, und Anwendungen auf Kunstwerke entstanden nur wenige Jahre später21,22.Proteomische Ansätze ermöglichen die sichere Identifizierung alter Proteinreste und die Unterscheidung der taxonomischen Spezies und des Ursprungsgewebes23, selbst wenn eine Mischung aus proteinhaltigen Materialien vorhanden ist.Die proteomische Charakterisierung von Farbproben von Kunstwerken ist besonders herausfordernd, weil: (1) Proben normalerweise in Sub-Milligramm-Mengen gesammelt werden, (2) es sich um komplexe Matrizen handelt, die reich an anorganischen Materialien wie Pigmenten sind, mit Kationen, die bekanntermaßen die Proteingewinnung negativ beeinflussen24 ,25, (3) das proteinhaltige Material macht nicht mehr als 10 % der Farbe aus26, und (4) die Proteine sind oft durch altersbedingten Abbau stark geschädigt.Diese Herausforderungen werden durch die Tatsache verdeutlicht, dass eine zuverlässige Identifizierung von Proteinen und ihrer biologischen Quelle bisher nur mit Proben erreicht werden konnte, die wesentlich größer waren als diejenigen, die routinemäßig für chromatographische und spektroskopische Analysen verwendet werden (bis zu einigen hundert Mikrogramm)22,27, 28,29.In dieser Studie wurden ein paläoproteomischer Arbeitsablauf, der für archäologische Proben30 entwickelt und zuvor für unpigmentierte Oberflächenschichten einer Fresko-Wandmalerei31 verwendet wurde, und modernste MS-Instrumente verwendet, um zu beurteilen, ob eine sichere Proteincharakterisierung aus kleinen Farbproben erreicht werden kann ( zehn Mikrogramm).Der Arbeitsablauf wurde zunächst an einem Satz von zehn Malmodellen getestet, die unter Verwendung verschiedener proteinhaltiger Bindemittel (Eigelb, Tierleim) und einer Vielzahl von Pigmenten mit unterschiedlichen Kationen, einschließlich aus Wollfasern extrahiertem Rotlack, hergestellt wurden (Tabelle 1).Die Mock-ups wurden verwendet, um zu verifizieren, dass Proteine in Farben mit unterschiedlichen anorganischen Zusammensetzungen sicher identifiziert werden konnten.Für jedes Mock-up wurden zwei Wiederholungen unterschiedlicher Größe analysiert, wodurch zwei als „klein“ und „groß“ gekennzeichnete Probensätze erstellt wurden (siehe Abschnitt 1.1 der Ergänzenden Informationen (SI)), die den Bereich der Probengrößen darstellen, die normalerweise gesammelt würden für die Lipid- bzw. Proteinanalyse durch Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS).Die für die GC-MS-Proteinanalyse erforderliche Probenmenge schließt häufig die Verwendung auf Kunstwerken aus.Außerdem führt die Aminosäurequantifizierung mit GC-MS nicht immer zu genauen Identifizierungen32.Diese Studie zielte stattdessen darauf ab, mithilfe von Tandem-MS-Paläoproteomik eine sichere Identifizierung von Proteinen aus kleineren Proben zu erreichen.Darüber hinaus ermöglicht die Paläoproteomik die Identifizierung der biologischen Spezies, von denen die nachgewiesenen Proteine stammen, und ihres molekularen Schadensprofils.Die Charakterisierung des Proteinschadens wird oft erreicht, indem das Ausmaß spontaner Modifikationen berechnet wird, die bestimmte Aminosäuren über große Zeitskalen betreffen.Zum Beispiel wurde die Desamidierung, eine spontane Reaktion, die im Laufe der Zeit an Asparagin- und Glutaminresten auftritt, zuvor in hohen Konzentrationen in alten proteinhaltigen Materialien beobachtet33,34,35.Nach den Mock-ups wurde der paläoproteomische Arbeitsablauf verwendet, um drei Proben zu analysieren, die von einem Tafelbild gesammelt wurden, das einer Konservierungsbehandlung unterzogen wird, „Die Jungfrau und das Kind mit dem Heiligen Johannes und einem Engel“ (um 1490), das der Werkstatt von Sandro Botticelli zugeschrieben wird (NG275 , National Gallery, London, UK).Die Proben wurden aus Bereichen entnommen, die unterschiedliche Pigmente enthielten (Tabelle 1 und Abb. 1).Ziel war es, den Proteinbinder in den mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie detektierten Farb- und Grundierungsschichten zu charakterisieren und vorläufig zu untersuchen, ob unterschiedliche Pigmente das beobachtete Proteinschädigungsmuster beeinflussen.Werkstatt von Sandro Botticelli.Die Jungfrau und Kind mit Johannes und einem Engel.Um 1490. Copyright: The National Gallery, London.Die roten Kreuze zeigen die zwei Stellen an, an denen drei Proben für die paläoproteomische Analyse entnommen wurden: 1:BP – blaue Farbe des Vorhangs;1:GL – Bodenschicht direkt unter Probe 1:BP;2:YP – gelbe Farbe des Kleidungsstücks.Diese Arbeit veranschaulicht, wie die proteomische Analyse von pigmentierten Mikroproben aus Kunstwerken eine detaillierte Charakterisierung der Art, Quelle und des Schadensstatus der verwendeten proteinhaltigen Materialien liefern kann.Obwohl kürzlich Richtlinien für die proteomische Analyse anderer Materialien des kulturellen Erbes veröffentlicht wurden36,37 und eine Reihe von Fallstudien verfügbar sind, die proteomische Ansätze auf Gemälde anwenden, erfolgt eine Erörterung der proteomischen Analyse von Gemälden nach bestem Wissen der Autoren , fehlt noch.Daher zielt diese Arbeit letztendlich darauf ab, Wissenschaftlern des Erbes Leitlinien für die Interpretation von Proteinsequenzierungsergebnissen solcher Objekte an die Hand zu geben.Die Analyse von Proben aus den 10 Modellen, die mit unterschiedlichen Kombinationen von Bindemitteln und Pigmenten hergestellt wurden, erlaubte die Identifizierung des verwendeten proteinhaltigen Bindemittels, entweder Tierleim oder Ei, bei allen großen und bei 8 der 10 kleinen Proben.Die Anzahl der Proteine, Peptide und MS/MS-Spektren, die die Identifizierung unterstützen, ist in der Ergänzungstabelle S1 angegeben.In vier der kleinen und allen großen Proben von mit Eigelb gebundenen Farben wurden auch Eiweißproteine identifiziert, nämlich Lysozym, Ovoinhibitor, Ovoalbumin und Ovotransferrin.Dies liegt wahrscheinlich an der manuellen Trennung der Gewebe (Eiweiß von Eigelb) während der Herstellung des Bindemittels, was oft nicht die vollständige Trennung der Eiweißproteine vom Eigelb gewährleistet.Daher weist der Nachweis von Eiweißproteinen nicht notwendigerweise auf die absichtliche Verwendung von Vollei und nicht nur von Eigelb hin.Die taxonomische Quelle des Eigelbs als Gallus gallus (Huhn) wurde für beide Probengrößen aller Mock-ups zuverlässig bestimmt, basierend auf der Identifizierung von mindestens einem Protein mit artspezifischen Peptiden für Huhn in jeder Probe.Die Sequenzen aller identifizierten nicht-speziesspezifischen Peptide stimmen noch mit der Huhn-Sequenz überein und können daher mit Bedacht dem Huhn zugeordnet werden.Tierleim von Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) wurde in allen großen Proben und in 2 der 4 kleinen Proben der Mock-ups identifiziert, wo er als Bindemittel der Farb- oder Grundierungsschicht vorhanden ist.Darüber hinaus wurde Kollagen Typ III, das als Indikator für Hautleim28,38 vorgeschlagen wurde, in den Farben E und F identifiziert. Diese Ergebnisse stimmen mit der bekannten Verwendung von Kaninchenhautleim in diesen Attrappen überein (Tabelle 1).Die Mock-ups G und H wurden absichtlich so beprobt, dass sie sowohl Farb- als auch Grundierungsschichten enthalten.Bei beiden Attrappen wurde in der großen, nicht aber in der kleinen Probe tierischer Leim aus der Bodenschicht identifiziert.Überraschenderweise wurden Hühner-Vitellogenin-2 und Ovalbumin durch einige wenige Peptide in den kleinen bzw. großen Proben von Farbe H identifiziert.Dieses Modell wurde in den 1930er Jahren hergestellt und als Leinöl- und Gelbockerfarbe auf einer Grundschicht aus Gipsleim beschriftet.Der Nachweis einer geringen Anzahl von Eipeptiden in beiden Proben könnte auf eine Kreuzkontamination der Farben während der Vorbereitung, Lagerung oder Probenahme hindeuten und zeigt, wie vorsichtig man die Ergebnisse interpretieren muss, wenn nur eine kleine Anzahl von Peptiden oder Proteinen nachgewiesen wird.In den Farben I und J, die Krapplackpigmente enthalten, die aus gefärbter Wolle hergestellt wurden (siehe Abschnitt 1.1 von SI), wurden mehrere nichtmenschliche Keratine, einschließlich schafspezifischer Peptide, sicher identifiziert (Ergänzungstabelle S4).Die identifizierten Proteine und die entsprechenden artdiagnostischen Peptide aus den Modellen sind in den Ergänzungstabellen S4 bzw. S5 angegeben.Diese Ergebnisse werden ausführlicher in Abschn.1 von SI.Die beiden farbhaltigen Proben aus „Die Jungfrau und das Kind mit Johannes und einem Engel“, 1:BP (Blaue Farbe) und 2:YP (Gelbe Farbe), zeigten eine sehr ähnliche Proteinzusammensetzung.Mit Hühnereigelb assoziierte Proteine (Vitellogenin-1, Vitellogenin-2, Apolipoprotein B) wurden in beiden Proben zuverlässig identifiziert (Ergänzungstabelle S6).Vogelserumalbumin, ein Protein, das in Eigelb, aber auch in Eiweiß und Blut vorhanden ist, wurde ebenfalls in Probe 2:YP identifiziert.Die Identifizierung dieses Proteins wurde nur durch zwei nicht-speziesspezifische Peptide unterstützt, was die genaue Identifizierung seiner Herkunftsspezies verhinderte.Beide Peptide sind jedoch mit der entsprechenden Hühnersequenz kompatibel, daher kann dieses Protein mit Bedacht auch dem Huhn zugeordnet werden.Peptide aus Kollagen alpha-1(I) und Kollagen alpha-2(I), die ausschließlich Ovis aries (Schaf) und Capra hircus (Ziege) zugeordnet wurden, wurden in allen Proben identifiziert, aber keine von ihnen erlaubte eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten .Kollagene sind die am häufigsten vorkommenden Proteine in vielen Körpergeweben wie Knochen, Haut und Sehnen39, und ihre Identifizierung ist wahrscheinlich auf die Verwendung von Tierleim zurückzuführen, der traditionell als organisches Bindemittel in der Vorbereitungsschicht von Tafelbildern verwendet wird2.Die identifizierten Kollagene erlaubten keine Unterscheidung des Gewebes, das zur Herstellung des Klebstoffs verwendet wurde, da in allen Proben nur Typ-I-Kollagen identifiziert wurden, die in fast allen Bindegeweben40 exprimiert werden.Proteine aus Eigelb und Tierleim wurden in beiden Proben 1:BP und 1:GL (Grundschicht) nachgewiesen, die an der gleichen Stelle von der Farb- bzw. Grundschicht gesammelt wurden.Der prozentuale Anteil an Peptiden, der für jede Proteinquelle pro Probe identifiziert wurde, spricht für die Verwendung von Eigelb als Farbbindemittel und Tierleim als Bindemittel in der Präparationsschicht, in Übereinstimmung mit den damals gängigsten Rezepturen2.Die Identifizierung beider Proteinquellen in der von der Farbschicht entfernten Probe (1:BP) ist wahrscheinlich auf die mechanischen Mittel zurückzuführen, mit denen die Proben gewonnen wurden (dh mit einem Skalpell), und auf die Dünnheit der Farbschicht (wenige µm), wodurch es fast unvermeidlich ist, dass beim Abschaben der äußeren Lackschicht versehentlich etwas von der unteren Präparationsschicht entfernt wird.Der Nachweis von Gips, der üblicherweise mit Tierleim in der Boden-/Vorbereitungsschicht vermischt ist, durch FTIR-Mikroskopie (Tabelle 1 und Ergänzungstabelle S3) zeigt auch, dass Probe 1:BP einen Teil der darunter liegenden Schicht enthielt.Die Identifizierung eines Eiproteins in Probe 1:GL könnte auf eine teilweise Entfernung auch der Farbschicht oder auf ein Eindringen der Farbe in die Vorbereitungsschicht während der Farbherstellung zurückzuführen sein.Die Anzahl der Proteine, Peptide und MS/MS-Spektren, die diese Schlussfolgerungen stützen, ist in Tabelle 2 angegeben. Die vollständige Liste der identifizierten nicht kontaminierenden Proteine ist in der Ergänzungstabelle S6 und die entsprechenden speziesdiagnostischen Peptide in der Ergänzungstabelle S7 aufgeführt.Alle gemeldeten Proteine wurden beim Abgleich der Spektren mit einer Referenzdatenbank identifiziert, die alle öffentlich verfügbaren Sequenzen für gängige proteinhaltige Farbbindemittel enthält (Abschnitt 5.4).Die Suche gegen die SwissProt-Datenbank, um andere Proteinquellen zu identifizieren, führte zu keinen weiteren Identifizierungen.Das Ausmaß der Desamidierung wurde berechnet und zur Beurteilung der Schädigung der proteinhaltigen Materialien verwendet (Abb. 2).Die Desamidierung von Asparagin war in den beiden Farbproben 1:BP und 2:YP vergleichbar, während der Grad der Glutamin-Desamidierung in der ersteren etwa doppelt so hoch war wie in der letzteren.Bei diesen Proben war die Desamidierung beider Aminosäurereste geringer als bei der Grundschichtprobe 1:GL.Die meisten der in dieser Probe identifizierten Peptide stammen aus den Kollagenen von Tierleim, der durch langes Kochen von Tierresten hergestellt wird, ein Prozess, von dem erwartet wird, dass er die Proteindesamidierung erhöht41.Um den Einfluss des Herstellungsprozesses auf die Proteinschädigung zu untersuchen, wurden die Deamidierungsgrade von Eiproteinen und Kollagenen getrennt für 1:BP und 2:YP analysiert, die beide mehr als ein Protein aus jeder Quelle enthielten.Das in Fig. 3 dargestellte Diagramm zeigt, dass der Desamidierungsgrad von Kollagenen für beide Proben höher war als der von Eiproteinen.Die Berechnungen für Kollagen basierten jedoch auf nicht mehr als 20 Peptiden in jeder Probe und für jede Aminosäure, was die Zuverlässigkeit der Berechnung einschränkte42.Prozentsatz der Desamidierung von Asparagin (N)- und Glutamin (Q)-Resten in den drei analysierten Proben.Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung um 1000 Bootstrap-Replikate an.Probenkennungen werden ganz oben angezeigt, während die Anzahl der für die Berechnung verwendeten Peptide über jedem Balken angezeigt wird.Prozentsatz der Desamidierung von Asparagin (N)- und Glutamin (Q)-Resten in Eiproteinen und Kollagen für die Proben 1:BP und 2:YP.Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung um 1000 Bootstrap-Replikate an.Probenkennung und Proteinklasse werden ganz oben angezeigt, während die Anzahl der für die Berechnung verwendeten Peptide über jedem Balken angezeigt wird.Die Suche nach Modifikationen im Zusammenhang mit Photooxidation31, einem Prozess, für den belichtete Gemälde möglicherweise sehr anfällig sind, führte zu keinen signifikanten Ergebnissen.Auch die Verwendung des MaxQuant Dependent Peptides Algorithmus führte nicht zum Nachweis anderer Proteinmodifikationen.Die aus den 10 Modellen erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass das angenommene Versuchsprotokoll eine sichere Charakterisierung von Proteinen aus dem Malen von Mikroproben ermöglicht.Die Identifizierung des proteinhaltigen Bindemittels und seiner biologischen Quelle wurde für alle großen Proben erreicht.Ausgehend von einer ähnlichen Probengröße hätten andere Methoden wie die Aminosäureanalyse möglicherweise die Unterscheidung des proteinhaltigen Materials ermöglicht, aber nicht die Identifizierung der Ausgangsspezies und des Gewebes.Die zuverlässige Identifizierung des proteinhaltigen Bindemittels und seiner Quelle in der Mehrzahl der kleinen Proben zeigt auch, dass die Empfindlichkeit des Protokolls eine Proteincharakterisierung in Proben ermöglichen kann, die sogar kleiner sind als die, die routinemäßig für andere Techniken gesammelt werden.Die Anzahl der nachgewiesenen Proteine und Peptide variiert im gesamten Satz von Modellen (Ergänzungstabelle S1).Es ist nicht klar, ob dies auf die Variabilität der Probenmenge zurückzuführen ist, da es nicht möglich war, die Mikroproben zu wiegen oder die Bindemittel-Pigment-Verhältnisse zu berechnen, oder auf das Vorhandensein verschiedener Pigmente, die nachgewiesen wurden die Proteinidentifizierung mit anderen Techniken beeinflussen24,25.Die in dieser Arbeit gesammelten Daten reichten nicht aus, um über die Faktoren zu spekulieren, die die Proteingewinnung beeinflussen, und es sind weitere Studien erforderlich, um die mögliche Beeinflussung der proteomischen Analyse durch die anorganischen Komponenten zu untersuchen.Die Farben I und J enthielten Krapplackpigment bzw. Leinöl und Eigelb als Bindemittel.Die Herstellung des Lackpigments umfasste die Extraktion des Farbstoffs aus gefärbter Schafwolle unter alkalischen Bedingungen bei hoher Temperatur.Diese Bedingungen begünstigen die Peptidbindungshydrolyse.Untersuchungen von Farbproben, die auf diese Weise hergestellte Pigmente enthielten, haben das Vorhandensein von Proteinrückständen innerhalb der Pigmentpartikel gezeigt43,44.Dies weist darauf hin, dass einige der Wollpeptide in das Pigment eingebaut sind und daher mit Proteomikanalyse nachweisbar sein sollten.Obwohl Keratine aufgrund der Probenhandhabung häufig als Kontaminanten in der Paläoproteomik identifiziert werden, wurden nichtmenschliche Keratine sicher in beiden Probengrößen von I und J mit Peptiden identifiziert, die nicht mit den menschlichen Sequenzen übereinstimmen (Ergänzungstabelle S5).Diese Ergebnisse zeigen, wie die durch Proteomik gewonnenen Informationen in einigen Fällen sogar zum Verständnis der Pigmentherstellung und nicht nur des proteinhaltigen Bindemittels beitragen können.Das Vorhandensein dieser pigmentverwandten Proteine hätte möglicherweise zu Fehlidentifizierungen geführt, wenn die Analyse mit einer anderen Technik durchgeführt worden wäre, wie z Profil proteinhaltiger Standardmaterialien45.Das Vorhandensein von Proteinen aus anderen Quellen als diesen Standards führt zu einem unbekannten Profil, was wahrscheinlich zu Fehlidentifizierungen oder falsch positiven Ergebnissen führt.Dieses Phänomen wurde bereits in der Literatur in Bezug auf Proteine von Mikroorganismen berichtet, die auf dem Gemälde vorhanden sind32.Die Untersuchung der Musterfarben bewies, dass der angenommene Arbeitsablauf, der auf modernster Massenspektrometrie und einem für alte Proteine optimierten experimentellen Ansatz basiert, zu einer zuverlässigen Charakterisierung von Proteinrückständen in Mikroproben aus Farbschichten führen kann .Die Anwendung dieses Arbeitsablaufs auf den Satz von drei Mikroproben, die aus dem Tafelbild The Virgin and Child entnommen wurden, das der Werkstatt von Sandro Botticelli zugeschrieben wird, führte zur Identifizierung von Hühnervitellogeninen und Apolipoproteinen in allen Farbproben, was auf die Verwendung von Eitempera hindeutet als Lackbindemittel.Die Verwendung von Vollei oder getrennt von Eiweiß und Eigelb als Farbbindemittel ist bekannt2 und wird in früheren Studien zu Gemälden aus Botticellis Werkstatt berichtet46.Die Unterscheidung zwischen Vollei, Eiweiß und Eigelb ist aufgrund der Identifizierung gewebespezifischer Proteine wie Vitellogenine und Apolipoproteine theoretisch möglich47, aber praktisch herausfordernd, da die manuelle Trennung von Eigelb und Eiklar nicht die Abwesenheit von Proteinkontamination garantiert zwischen den beiden Geweben.Dennoch wurden in den analysierten Proben nur mit Eigelb assoziierte Proteine und keine Eiklarproteine identifiziert, was darauf hindeutet, dass ausschließlich Eigelb verwendet wurde.Kollagene von Schafen oder Ziegen wurden in allen Tafelbildproben nachgewiesen.Kollagene sind die Hauptproteinkomponente von Tierleim, einem Material, das häufig in Kunstwerken verwendet wird2.Der Prozentsatz an Kollagenpeptiden in der für die Grundschicht repräsentativen Probe (1:GL) ist höher als in den für die Farbschicht repräsentativen Proben (1:BP und 2:YP) (Tabelle 2), was darauf hindeutet, dass wahrscheinlich Tierleim verwendet wurde als Bindemittel in der Grundschicht.Der Desamidierungsgrad der aus den Lackschichtproben 1:BP und 2:YP extrahierten Proteine war vergleichbar.Im Gegensatz dazu zeigte Probe 1:GL, die aus der Grundschicht gesammelt wurde und hauptsächlich Kollagen enthielt, höhere Desamidierungsraten (Abb. 2).Dies liegt wahrscheinlich an der Herstellung des Tierleims, der ein längeres Kochen von Tierresten erfordert.Es wird erwartet, dass dieser Prozess die Desamidierung der Proteine fördert, da die Temperatur einer der Hauptfaktoren ist, die die Kinetik der Reaktion beeinflussen48.Der signifikante Einfluss der Herstellung solcher Materialien auf Proteinschäden wurde bereits beobachtet31.Interessanterweise wurde trotz des Vorhandenseins von Pigmenten in der Farbe, die gemeinhin als Photosensibilisatoren betrachtet werden,31,49, und der Lichteinwirkung auf das Kunstwerk kein lichtbedingter Proteinschaden beobachtet.Das Fehlen von Schäden könnte auf Faktoren zurückzuführen sein, die die Farbe schützen, wie z. B. ein Rahmen, da alle Proben vom Rand des Gemäldes entfernt wurden, oder auf das Vorhandensein einer Firnisschicht.Dennoch reichen die gesammelten Daten nicht aus, um darüber zu spekulieren, warum bei den identifizierten Proteinen keine signifikanten Lichtschäden beobachtet wurden oder warum die unterschiedlichen Pigmente in den beiden analysierten Farben keine nachweisbaren unterschiedlichen Proteinabbaumuster verursachten.Der Photooxidationsgrad der Farbe in anderen Bereichen des Anstrichs sollte untersucht werden, und weitere Studien sind erforderlich, um die Protein-Photooxidation in einem komplexen Farbsystem zu charakterisieren, mit besonderem Fokus auf den Einfluss der anorganischen Komponenten.Bei proteomischen Analysen von Kunstwerken beschränkt sich die Identifizierung von schadensbedingten Modifikationen üblicherweise auf Desamidierungs- und Photooxidationsschäden.Die Identifizierung anderer Modifikationen kann jedoch Informationen über die Erhaltung und Anzeigegeschichte des Objekts liefern.An den Proben des Gemäldes wurde auch eine Suche nach nicht näher bezeichneten posttranslationalen Modifikationen (PTMs) durchgeführt, aber es wurden keine neuen Modifikationen auf signifikantem Niveau festgestellt.Da proteomische Analysen in der Kulturerbewissenschaft immer häufiger eingesetzt werden, hat sich gezeigt, dass eine Reihe von Good-Practice-Richtlinien für die Analyse solcher Ergebnisse erforderlich sind.Ähnliche Richtlinien wurden kürzlich für die paläoproteomische Analyse anderer Materialien veröffentlicht36,37.Die in solchen Richtlinien enthaltenen Ratschläge können auch auf die Analyse von Proteinen in Kunstwerken angewendet werden, einschließlich der Vermeidung der Verwendung von Materialien, von denen bekannt ist, dass sie eine Proteinkontamination verursachen, wie z. B. Latexhandschuhe50.Dennoch ist ein auf das Studium der Malerei und ihre spezifischen Herausforderungen zugeschnittenes Regelwerk von Vorteil.Daher kann die Analyse der drei Tafelbildproben von oben verwendet werden, um zu veranschaulichen, wie die in einem Kunstwerk vorhandenen proteinhaltigen Materialien am besten identifiziert und charakterisiert werden können.Die Identifizierung von Proteinen in einer Probe basiert normalerweise auf dem Vergleich zwischen experimentellen MS/MS-Spektren und theoretischen Spektren, die von einer Software aus der vom Benutzer ausgewählten Datenbank generiert wurden, dh den Proteinsequenzen, nach denen die Software in der Probe sucht.Die Wahl der Datenbank ist von größter Bedeutung, da nur die in der Datenbank vorhandenen Proteine in der Probe gefunden werden.Daher sollten idealerweise alle verfügbaren Proteinsequenzen enthalten sein.Die Verwendung sehr großer Datenbanken (wie der TrEMBL-Datenbank von Uniprot51) erhöht jedoch drastisch die für die Suche erforderlichen Rechenressourcen und die Wahrscheinlichkeit von Fehlidentifikationen.Die Identifizierung aller in der Probe vorhandenen Proteine und die Auswahl der Datenbank können daher zu einem iterativen Prozess werden.Für die erste Suche sollte jegliches allgemeine Wissen über die mögliche Probenzusammensetzung verwendet werden, um eine möglichst kleine Datenbank von Proteinen aufzubauen.Bei Materialien, die in Gemälden verwendet werden, reicht oft eine Suche in einer Datenbank, die nur die häufigsten Proteine in Kunstwerken (Ei, Kollagene und Milchproteine) enthält.Die Proben sollten dann mit einer größeren Datenbank abgeglichen werden, um sie auf das Vorhandensein anderer Proteine und unerwarteter Proteinquellen zu testen.Alle zusätzlichen Treffer werden dann in eine neue, eingeschränktere Datenbank aufgenommen.In dieser Studie wurden Proben zunächst gegen die gängigsten proteinhaltigen Farbbindemittel durchsucht.Anschließend wurden sie gegen die Swiss-Prot-Datenbank von Uniprot51 durchsucht.Die zweite Suche führte bei den Anstrichproben zu keiner weiteren Identifizierung, während sie bei zwei der Mock-up-Anstriche die Identifizierung von nicht-menschlichen Keratinen ermöglichte, die aus den mit dem Krapplack co-extrahierten Wollpeptiden stammen (siehe Abschn 1.1 SI).Daher wurde eine dritte Suche an diesen Proben mit einer Datenbank durchgeführt, die die öffentlich zugänglichen Sequenzen für Schafkeratine enthält, was zur Identifizierung mehrerer speziesspezifischer Schafpeptide führte (siehe Abschnitt 1.2 von SI).Bei der Erstellung der aus der Datenbank abgeleiteten theoretischen Spektren muss die Software wissen, nach welchen Peptiden gesucht werden muss und wie Proteine in silico „verdaut“ werden können.Wenn die Probe mit einem Enzym verdaut wurde, schneidet die Software die Proteinsequenzen in der Datenbank entsprechend der Enzymspezifität.Wird kein enzymatischer Verdau durchgeführt oder besteht Grund zur Annahme einer unspezifischen Proteinhydrolyse (z. B. aufgrund von fortgeschrittenem Alter und/oder Schädigung der Proteine), kann eine unspezifische Suche durchgeführt werden.In diesem Fall sucht die Software nach jedem möglichen Peptid aus den Proteinsequenzen in der Datenbank (begrenzt durch benutzerdefinierte minimale und maximale Länge).Wie die Verwendung einer großen Datenbank erfordert diese Art der Suche jedoch mehr Rechenressourcen und erhöht die Wahrscheinlichkeit von Fehlidentifikationen.Daher wird eine unspezifische Suche nur empfohlen, wenn das Material stark degradiert ist, was anhand von Schadensbildern wie Deamidierung beurteilt werden kann, und/oder wenn bekannt ist (oder vermutet wird), dass das Material unter harten Bedingungen behandelt wurde.In dieser Studie wurde eine unspezifische Suche an Mock-ups durchgeführt, die Krapplack enthielten, wo das Vorhandensein von unspezifisch gespaltenen Peptiden aufgrund der Pigmentextraktion aus Wolle mit einem starken Alkali bei hoher Temperatur erwartet wurde (siehe Abschnitt 1.1 von SI ).Die unspezifische Suche an diesen Proben führte zur Identifizierung vieler kurzer und nicht enzymatisch gespaltener Peptide.Der erste Schritt bei der Analyse der Ergebnisse jeder proteomischen Studie besteht darin, festzustellen, welche Identifizierungen als sicher und signifikant angesehen werden können und welche aufgrund unzureichender Beweise verworfen werden müssen.Es ist eine gängige Praxis in der Paläoproteomik, ein Protein nur dann als zuverlässig identifiziert zu betrachten, wenn mindestens zwei nicht überlappende Peptide identifiziert wurden, die für dieses Protein einzigartig sind36,52.„Non-overlapping peptides“ bedeutet in diesem Fall, dass eines der Peptide die Aminosäuresequenz des anderen nicht vollständig abdeckt, sie also unterschiedliche Sequenzbereiche abdecken müssen (Abb. 4).Darüber hinaus wird die Identifizierung von Peptiden einem Bewertungssystem unterzogen, das sich auf die Qualität der für dieses Peptid erfassten MS/MS-Spektren stützt.In der MaxQuant-Software wird der Peptid-Score aus mehreren Parametern berechnet, basierend auf dem Vergleich des experimentellen Spektrums mit den theoretischen Spektren, die von der Software aus der Proteindatenbank generiert wurden53.Während der Datenanalyse wird normalerweise ein Score-Schwellenwert festgelegt, um Spektren von geringer Qualität auszuschließen, die eine schlechte Peptididentifikation aufweisen würden.Teil der Sequenz von Hühner-Vitellogenin-2 (P02845).Die Zahlen über der Sequenz geben die Start- und Endpositionen des gezeigten Peptids an.Der Nachweis nur der tryptischen Peptide (1) und (2) in Rot reicht für die Proteinidentifizierung nicht aus, da die Aminosäuresequenz von Peptid (1) vollständig von Peptid (2) abgedeckt wird.Die Peptide (1), (3) und (4) überlappen sich nicht und können daher zur Identifizierung des Proteins verwendet werden.Die Peptide (2), (3) und (4) können trotz der teilweisen Überlappung der Peptide (2) und (4) zur Proteinidentifizierung verwendet werden, da keines die Sequenz des anderen vollständig abdeckt.Die Bestimmung des taxonomischen Ursprungs eines Proteins basiert auf der zuverlässigen Identifizierung mindestens eines speziesspezifischen Peptids, dh nicht übereinstimmend mit irgendeiner anderen sequenzierten Spezies, wobei die charakteristische(n) Aminosäure(n) von mindestens einem Ionenfragment bedeckt ist (sind).Da die für die Suche verwendete Datenbank in den meisten Fällen eine begrenzte Anzahl von Proteinen enthält, sollte die Spezifität jedes Peptids verifiziert werden, indem seine Sequenz mit allen öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen verglichen wird.Dies kann leicht über Suchmaschinen wie das NCBI-Tool BLAST54 erfolgen, das alle Proteine anzeigt, die die Abfragesequenz enthalten, sowie die nahen Übereinstimmungen.Bei der Beurteilung der Spezifität des Peptids sollte auch überprüft werden, dass kein Aminosäureaustausch die Ursache für ein falsch positives Ergebnis sein könnte.Insbesondere drei Fälle sind sehr häufig: (1) Leucin- und Isoleucin-Substitution: die zwei Reste haben unterschiedliche Strukturen, aber genau die gleiche Masse und können nicht durch Tandem-MS-Analyse unterschieden werden;(2) Asparagin und Asparaginsäure sowie Glutamin- und Glutaminsäuresubstitutionen: Eine Unterscheidung ist nur möglich, wenn die nicht desamidierte Form sicher durch mindestens ein Spektrum identifiziert wird;Appl.ADS-CAS-Artikel Google ScholarAppl.Phys.ADS-CAS-Artikel Google ScholarADS-CAS-Artikel Google ScholarAnal.Anal.Appl.Anal.IntelligenzSyst.Anal.ADS-CAS-Artikel Google ScholarADS CAS Artikel PubMed Google ScholarAnal.CAS-Artikel PubMed Google ScholarAnal.Anal.Anal.CAS-Artikel PubMed PubMed Central Google ScholarInt.AuflösungAnal.Nat.Ecol.Wissenschaft.AuflösungAnal.Stier.Stier.CAS-Artikel PubMed Google ScholarWissenschaft.ADS CAS Artikel PubMed Google ScholarCAS-Artikel PubMed PubMed Central Google ScholarWissenschaft.Nat.biol.Nat.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie 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